大蒜绿变色素分离纯化及结构鉴定

目录
1 引言·············································································································· 5 1.1 大蒜的化学成分及生理功能 ··································································· 5 1.2 国内外有关葱属植物变色的研究························································ 6 1.2.1 洋葱泥的红变 ························································································ 6 1.2.2 大蒜的绿变···························································································· 6 1.3 天然色素分离纯化的方法及相关问题···················································· 9 1.4 天然有机化合物结构鉴定方法 ····························································· 10 1.5 大蒜产业的现状及前景 ········································································· 11 1.6 本课题的研究目的、内容和意义·························································· 12 1.6.1 研究目的······························································································ 12 1.6.2 研究内容······························································································ 12 1.6.3 本研究的意义 ······················································································ 13 2 材料与方法································································································ 15 2.1 试验材料································································································· 15 2.2 主要试剂································································································· 15 2.3 主要仪器设备 ························································································· 15 2.4 实验方法································································································· 16 2.4.1 大蒜绿变色素粗提液的制备 ······························································ 16 2.4.2 绿色素紫外-可见光谱扫描 ······························································ 17 2.4.3 HPLC 法分离检测绿色素方法的建立················································ 17 2.4.4 固相萃取法分离纯化大蒜绿色素······················································· 17 2.4.5 吸附树脂法分离纯化大蒜绿色素······················································· 18 2.4.6 凝胶层析法分离纯化大蒜绿色素······················································· 18 2.4.7 分离纯化工艺的优化 ·········································································· 18 2.4.8 液质联用分析绿色素物质分子量······················································· 19 2.4.9 核磁共振分析绿色素物质结构··························································· 19 2.4.10 红外光谱分析绿色素物质结构························································· 19

2.4.11 大蒜绿变色素光稳定性的研究························································· 20 3 结果与分析································································································ 21 3.1 大蒜绿色素紫外-可见吸收光谱·························································· 21 3.2 HPLC 法分离检测绿色素方法的建立··················································· 22 3.2.1 色谱柱的选择 ······················································································ 22 3.2.2 流动相的选择 ······················································································ 23 3.2.3 检测波长的选择 ·················································································· 24 3.2.4 最佳色谱条件及绿色素保留时间的确定··········································· 25 3.3 大蒜绿色素的分离纯化 ········································································· 25 3.3.1 固相萃取法分离纯化大蒜绿色素······················································· 25 3.3.2 吸附树脂法分离纯化大蒜绿色素······················································· 27 3.3.3 凝胶层析法分离纯化大蒜绿色素······················································· 29 3.3.4 分离纯化工艺的优化 ·········································································· 30 3.3.5 纯化后样品的吸收光谱图及液相色谱图··········································· 32 3.4 液质联用解析绿色素物质分子量·························································· 34 3.5 核磁共振分析绿色素物质结构 ····························································· 36 3.6 红外光谱分析绿色素物质结构 ····························································· 37 3.7 大蒜绿变色素光稳定性的研究 ····························································· 38 4 讨论············································································································ 41 4.1 大蒜绿变色素粗提液的制备 ································································· 41 4.2 大蒜绿色素的分离纯化 ········································································· 41 4.3 大蒜绿变色素的液相色谱分离 ····························································· 41 4.4 大蒜绿色素物质的结构解析 ································································· 41 4.5 大蒜绿色素稳定性的研究 ····································································· 42 4.6 进一步研究方向 ····················································································· 42 4.6.1 大蒜绿变色素的结构鉴定 ·································································· 42 4.6.2 大蒜绿变机理的研究 ·········································································· 42 5 结论············································································································ 44 5.1 大蒜绿变色素的分离纯化工艺的确定·················································· 44 5.1.1 高效液相色谱法分离检测大蒜绿变色素··········································· 44
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5.1.2 大蒜绿变色素的分离纯化的方法······················································· 44 5.2 绿色素物质的分子量测定和结构鉴定·················································· 44 5.2.1 液质联用测定绿色素物质分子量······················································· 44 5.2.2 绿色素物质结构鉴定 ·········································································· 44 5.3 大蒜绿变色素光稳定性的研究 ····························································· 44 参考文献······································································································· 46 致谢 ·············································································································· 53 攻读学位期间发表论文情况 ······································································· 54
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摘要
大蒜(Allium Sativum L.)为百合科葱属植物。蒜的鳞茎具有极高的 营养价值,含有蛋白质、糖类、脂肪、维生素和钙、磷、铁、硒、锗等 矿物元素。我国是大蒜的主要生产国,其产量占世界总产量的四分之 三。除鲜食外,大蒜还经常加工成蒜泥、蒜汁、脱水蒜片、蒜粉等制 品,但在加工过程中常常出现绿变现象,严重的影响了产品的外观质 量,成为妨碍大蒜进一步加工的主要问题。因此研究大蒜制品绿变的机 理,对有效控制发绿现象,达到规模化生产具有重要意义。本实验以大 蒜鳞茎为原料,通过浸提法制备大蒜绿色素粗提液,采用固相萃取法, 吸附树脂法和凝胶层析法对大蒜绿色素进行了分离纯化的研究;利用液 质联用技术测定大蒜绿色素的分子量,并通过核磁共振,红外光谱技术 对色素样品进行结构分析;同时研究了大蒜绿色素的光稳定性,为大蒜 绿变的机理研究提供了理论依据。
1.大蒜绿变色素的分离纯化 试验建立了高效液相色谱法(HPLC)分 离检测大蒜绿变色素的方法,确定了检测大蒜绿变色素的最佳色谱条件 如下:Alltech Alltima C18(250mm×4.6mm)色谱柱,流动相为乙腈∶ 水 =2 ∶ 8 ( 含 0.1% 甲 酸 ) , 柱 温 30 ℃ , 检 测 波 长 440nm , 流 速 1.0mL/min。在该液相色谱条件下,大蒜绿色素中两种物质的保留时间分 别为 2.89min 和 3.95min。
在此基础上采用各种柱层析方法对大蒜绿变色素进行了分离纯化的 研究,并利用高效液相色谱对其效果进行检验。第一步纯化通过固相萃 取法和吸附树脂法进行比较,从四种 SPE 小柱和两种大孔树脂中筛选出 最佳柱材料为 XAD-16 型大孔吸附树脂。实验表明,大蒜绿色素粗提液 通过 XAD-16 型大孔树脂,用含 0.2%HCl 的甲醇洗脱,洗脱流速在 1BV/h,收集到的绿色素流出液纯化效果较好。二次纯化采用 Sephadex LH-20 凝胶树脂进行分离纯化,用纯甲醇作为洗脱液,流速在 1.2BV/h, 即可获得较高纯度的样品。
2.绿色素物质的分子量测定和结构鉴定 试验通过液质联用技术测 定绿色素物质的分子量,结果显示绿色素分子量为 527。同时制备绿色 素固体样品,通过核磁共振,红外光谱技术对其进行结构鉴定。核磁共
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振初步确定绿色素物质:①有吡咯环,且上有含 H 的取代基 ②有不饱 和键,C=C ③有甲基。红外光谱初步确定绿色素物质:①属于芳香族杂 环化合物,推测是含 N 的吡咯衍生物。②有-CH3、-OH 、C=C 和 C=S。
3.大蒜绿色素光稳定性的研究 采用测定吸光值以及紫外可见光扫 描的方法,研究了各种不同性质光线对色素稳定性的影响,试验结果表 明,绿色素对光的耐受性较差,室外自然光和紫外线对色素影响明显, 其中紫外线对其影响最显著。光照后绿色素中蓝色素组分完全消失,黄 色素组分含量降低。 关键词:大蒜;绿色素;分离纯化;结构;性质
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ABSTRACT
Garlic(Allium Sativum L.)is liliaceous plant, the bulb of garlic is rich in nourishment including protein, carbohydrate, fat, vitamin and mineral element such as Ca、P、Fe、Se、Ge and so on. China is a huge producing country of garlic whose yield occupy 76 percent of the whole world. Garlic is often made into different kind of products except eating in fresh. But garlic always becomes green in the process and has bad effect on character, so it is in great need to solve this problem. Garlic green pigment was separated and purified by the methods of solid phase extraction (SPE), macroporous adsorption and gel filtration chromatography. The green pigment was characterized by liquid chromatography-mass spectrum(LC-MS) , nuclear magnetic resonance(NMR) spectroscopy, and infrared spectrum(IR). The light stability of garlic green pigment was also studied to offer theoretical basis for mechanism of garlic greening.
1. Isolation and purification of the green pigment Method of HPLC to isolate and detect the pigment was established. The detecting conditions were that: Alltech Alltima C18 column (250mm×4.6mm), mobile phase: acetonitrile:water = 2:8 (0.1% formic acid), column temperature: 30 ℃ , detection: UV at 440 nm, flow rate: 1.0mL/min.
Garlic green pigment was separated and purified by a series of column chromatography, and the purity of green pigment was tested by the methods of HPLC. The purification procedures were as follows: let the raw green extracts passed XAD-16 macroporous resin adsorption firstly, 0.2%HCl methanol as the elution solvent,1BV/h as the flow rate. The green outflow was then passed Sephadex LH-20 gel resin, methanol as the elution solvent, 1.2BV/h as the flow rate on desorption to achieve high purification.
2. Molecular weight mensuration and structure identification of the green pigment The LC-MS result showed that the MW of green pigment was 527. Purified solid of green pigment was obtained to identify structure through NMR and IR. NMR spectrum showed that green pigment: ① contain pyrrole ring which substituent contain H; ② contain unsaturated carbon such as C=C; ③ contain-CH3. IR spectrum showed that green pigment: ① belong to aromatic heterocyclic compound, conjecture it be pyrrole derivatives containing N; ② contain -CH3,-OH ,C=C&C=S.
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3. Light stability of the green pigment The effect of different light factors on the stability of green pigment was studied using UV-visible spectrophotometric methods. The results showed that green pigment had a little stability under light. The effect of outdoor natural light and ultraviolet light was obvious to the stability of green pigment, and ultraviolet light had destructive effect on it. Green color went away while yellow color presented in the sample. Key Words: garlic; green pigment; isolation; purification ; structure; property
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1 引言
大蒜(Allium Sativum L.)为百合科葱属植物,主要食用部分为鳞 茎。大蒜原产亚洲西部,中国早在 2000 多年前就开始种植,我国大蒜资 源十分丰富,年产量占世界产量的 3/4,除鲜食外大蒜还经常加工成蒜 泥、蒜汁、脱水蒜片、蒜粉等制品(陈功等,2003)。大蒜味道鲜美、 营养丰富、药用价值高,不仅是我们日常生活中不可缺少的调味品,还 是具有多种生理活性的功能食品。
大蒜数千年来在中国、埃及、印度等国一直是一种药食两用的食 品,含有多种生理活性成分。国内外的科学家们对大蒜的研究都给予高 度的重视,从药理、临床、应用等各个领域进行了比较深入系统的研 究,获得了大量的研究成果,证明了大蒜不仅是一种优良的保健食品, 而且是一种具有广泛用途的天然药品。*年来,随着人们保健意识的增 强,日益强调食品原料及添加剂的天然性、功能性,使得人们更加关注 大蒜的药食兼用的特性。2002 年美国《时代周刊》专辑推荐大蒜为现代 人十大最健康的食品之一。我国是世界上大蒜的主要生产国和主要出口 贸易国之一,大蒜产业在我国有着举足轻重的地位。因此,研究开发利 用大蒜资源具有重要意义(李蕾,2005)。 1.1 大蒜的化学成分及生理功能
大蒜的营养价值较高,其化学成分复杂且齐全,主要含有蛋白质、 糖类、脂肪、维生素和钙、磷、镁、铁、硒、锗等矿物元素。大蒜含有 人体中几乎所有的必需氨基酸,其中赖氨酸、亮氨酸、缬氨酸的含量较 高,蛋氨酸的含量较低。总之,大蒜中氨基酸种类比较齐全,营养价值 较高(陈功等,2003)。大蒜中矿物质含量以磷最高,其次为镁、钙、 铁、硅、铝和锌等,另外有机锗和硒的含量也较高(谢周芳,2001)。 不同产地的大蒜化学成分的含量随产地、品种的不同有所差异。
除上述化学成分外,大蒜中还含有一些酶类。包括蒜酶、大蒜超氧 化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶、γ-谷胺酰转肽酶等(Ceci L.N.et al,1992),其中蒜酶和γ-谷胺酰转肽酶与大蒜绿变密切相关(江英 等,2002)。
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大蒜所具有的保健功能是与其富含的大蒜油、有机硒、超氧化物歧 化酶(SOD)等活性成分有关。由于大蒜所含众多的生物活性物质,具 有特殊的医疗保健作用,常吃大蒜,可以提高机体免疫力,杀菌、抗 癌、防治冠心病及动脉硬化、抗氧化、减少自由基生成,延缓衰老。 1.2 国内外有关葱属植物变色的研究 1.2.1 洋葱泥的红变
1959 年,Lucks 在研究洋葱泥的红变时,用乙醚提取到一种无色醚 溶性前体物(Color developer)。在此物质的行程中,酶是必需的,他还 发现当纯氨基酸与含有醚溶性前体物的提取液混合时,红色素形成了, 他提出氨基酸参与了色素的形成(Lucks,1959)。后来,Jolsyn 和 Peterson 证实了 Lucks 关于醚溶性前体物形成时,酶是必需的,且此酶是 蒜氨酸酶,同时他们的研究还表明,羰基化合物在色素的形成过程中也 是必需的(Jolsyn,1960)。Shannon 等人的研究表明,在洋葱泥红色素 的 形 成 中 , 存 在 着 第 二 种 无 色 非 醚 溶 性 的 色 素 前 体 物 ( Pigment precursor),其形成是通过加热 Color developer 和氨基酸,然后此化合 物再与羰基化合物形成色素,而形成的颜色随羰基化合物而异,如甲醛 形 成 红 色 、 不 饱 和 酮 形 成 蓝 绿 色 、 丙 稀 醛 则 形 成 蓝 色 素 ( Shannon , 1967)。 1.2.2 大蒜的绿变
大蒜绿变在蒜加工过程中比较常见,有关大蒜绿变的研究,国外从 五六十年代就已经开始了,多数集中于绿变过程的推理。1944 年,Cruss 报道了在某些时候,将大蒜打成泥后,再加入乙酸,就会变成绿色。 Jolsyn 通过试验得出大蒜绿色素不是叶绿素,其形成与酚酶和过氧化物 酶无关(Jolsyn,1956)。后来 Lucks 等研究表明,大蒜在较高温度贮 藏,可抑制蒜泥的绿变,而在低温下贮藏,则易变绿。在不产生绿变的 大蒜中,PECSO(反式–(+)–S–(1–丙烯基)–L–半胱氨酸亚砜)的 含量很低,在产生绿变的大蒜中,PECSO 的含量很高;在较高温度贮藏 的大蒜中,PECSO 的含量很低,而低温贮藏的大蒜中 PECSO 的含量增 加。如将少量 PECSO 添加到不能绿变的蒜泥中,则会使蒜泥变绿,添加 量在 0.1~1.8mg 绿变程度与 PECSO 的添加量呈直线关系,由此证实了
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PECSO 的存在是蒜泥变绿的原因(Lucks,1986)。国内也有研究证明, 在蒜泥绿色素形成的过程中,氨基酸也是必须的,而不同的氨基酸形成 的色素不同,只有氨基和羰基游离的氨基酸才能形成色素。同时,在蒜 泥色素的形成中,羰基化合物参与了反应,而且所形成的色素的颜色随 着羰基化合物而异(江英,2002)。
大蒜绿变的过程和机理鲜有报道。Imai 等通过宏观的化学实验认为 PECSO,ACSO 和大蒜中的蒜酶参与了色素的形成。1986 年,Lucks 的 研究表明,PECSO 是蒜泥绿变的主要物质之一。结合对洋葱红变的研究 结果,推断蒜泥绿色素的形成的过程可能为:
大蒜 ↓ 打破休眠 ↓ 反式–(+)–S–(1–丙烯基)–L–半胱氨酸亚砜(PECSO) 很快↓蒜酶 (alliinase) 色素中间体 (color developer) 很慢↓+游离氨基酸 (free amino acid) 色素前体物 (pigment precursor) 慢 ↓+羰基化合物 (carbonyl) 绿色素 在这个过程中,γ–谷氨酰转肽酶起水解酶的作用。它可使蒜中的 某种γ–谷氨肽水解,产生可使蒜泥绿变的前体物质,此物质在休眠的 蒜中不存在或含量极少。有研究表明,在不产生绿变的大蒜中,S–1– 丙烯基–L–半胱氨酸亚砜(S–1–propenyl–L–cysteine sulfoxide 即 PECSO) 的含量很低,在产生绿变的大蒜中,PECSO 的含量很高。有研究表明盐 酸羟胺是蒜酶的抑制剂,在蒜泥中加入一定量的盐酸羟胺可以抑制蒜泥 的绿变,在已用盐酸羟胺抑制绿变的蒜泥中再加入蒜酶,蒜泥又变绿了,说 明蒜酶也参与了反应。 Shinsuke Imai 等人通过体外的模式反应提出的大蒜绿变的反应机理 是∶第一步为 PECSO 在蒜酶的催化下生成丙烯基硫代亚磺酸酯;第二步
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为丙烯基硫代亚磺酸酯与氨基酸反应生成色素前体;第三步为 ACSO (烯

丙基半胱氨酸亚砜)在蒜酶的催化下生成烯丙基硫代亚磺酸酯;第四步为

烯丙基硫代亚磺酸酯与色素前体生成色素(Imai S, 2006)。

楠丁呼思勒通过外源加入吡咯基缬氨酸可以使蒜变绿,证明了它可

能就是大蒜绿变的前体物质。一些吡咯基氨基酸化合物的确有些可以作

为大蒜绿变反应的色素前体物质,与大蒜中其它成分反应生成绿色,比如

缬氨酸-吡咯,但并不是所有氨基酸-吡咯化合物都可以作为色素前体物

质来参加色素反应,比如吡咯基亮氨酸,说明大蒜绿变色素对形成色素

的前体有着严格的结构上的要求(楠丁呼思勒,2007)。

关于大蒜绿变产物绿色素的分离纯化和结构研究*几年才刚刚起

步。王岩等对大蒜绿色素物质的提取条件进行了研究,试验结果表明,

大蒜绿变物质浸提的最佳条件是:80%(V/V)甲醇溶液,按料液比 1∶

3(g/ml),室温浸提 24h。利用薄层层析法进行色素的分离,展层剂为含

77%(V/V)甲醇,3%(V/V)乙酸乙酯,0.24%(V/V)HCl 的水溶液,可达到

初步分离的目的。

赵晓丹等对大蒜绿色素的分离纯化进行了初步的研究。根据色素的

极性,选用的几种分离介质为大孔树脂、聚丙烯酰胺、弱阳离子交换树

脂、硅胶、Sephadex LH-20。经预选实验,选出弱阳离子交换树脂 CG-

50、Sephadex LH-20 作为分离介质。色素经分离后,得到黄色和蓝色两

条色带,对比两者在可见光范围的最大吸收波长于色素粗提液的最大吸

收波长,赵晓丹等认为大蒜绿色素是由这两种色素共同作用的结果。

对于绿变产物的研究,韩国 Enu-Jin Lee 等最新研究表明,收集经过

XAD-16 大孔吸附树脂和 Sephadex LH-20 凝胶树脂纯化后的大蒜绿色素

物质,对样品进行液质联用,基质辅助激光解析电离飞行时间质谱,快

速原子轰击质谱以及核磁共振分析,得出结论:大蒜绿色素物质分子量

约 412,可能的分子式有以下几种:

C25H17N1O3S1 C25H33N3O1S1 C26H21N1O2S1 C27H25N1O1S1

C25H21N3O1S1 C25H49N1O1S1 C26H37N1O1S1 C28H13N1O1S1

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并指出该物质含一个 S 原子,奇数个 N 原子,25-30 个 C 原子,核 磁共振证明该物质含有 R-CH3,R-CH2-R,R-CH2-O,C=C,C=O 和苯 环。
另外,也有人进行了大蒜绿变影响因素的研究,当大蒜在 0℃贮藏 时,随时间延长大蒜绿变增强,在 20℃贮藏一段时间后,大蒜绿变程度 基本不变,而在 35℃贮藏时,随时间的延长,大蒜绿变的程度减轻,这 说明在大蒜采收后,贮藏温度越低,在加工中越容易引起发绿现象,而 随着在较高温度下贮藏时间的延长,绿变会逐渐减弱;还原剂对大蒜绿 变有一定的抑制作用,添加 L–半胱氨酸后,随着 L–半胱氨酸浓度的 增大,大蒜产品的绿变很快减轻;pH、杀菌温度及杀菌时间则对大蒜变 绿的影响不大(江英,2001;徐为民,2003;别小妹,1998)。 1.3 天然色素分离纯化的方法及相关问题
目前有关天然色素的分离纯化传统且有效的方法就是色谱法,也称 层析法,国内外天然色素的分离纯化都是以色谱法为主。很多新的色素 也都是用这种经典的方法成功的被分离提纯出来,因此将其应用到大蒜 绿变色素的分离提纯方面也应该是可行的(赵晓丹,2005)。
色谱法又分为柱色谱和薄层色谱,柱色谱是制备分离有机物的最常 见的实验技术。柱色谱是将通过有机物在固定相和流动相两相间的不同 分布来达到分离目的。固定相大多为固体并被首先装入柱中,流动相大 多为液体,在有机样品上样后再加入柱中进行洗脱。在色谱分离中,分 离介质即填料是决定分离效率的关键因素。目前比较常见的分离材* 括硅胶、氧化铝、大孔吸附树脂、离子交换树脂、聚酸胺树脂和凝胶树 脂等。
大孔树脂吸附分离是目前色素分离纯化的常用方法。根据不同色素 的性质选择特定的吸附剂,用吸附、解吸法精制色素,广泛应用于色素 的分离、制备与提纯。萧伟祥等用树脂吸附分离制取茶多酚,得率高达 18%-21%;彭永芳等用大孔吸附树脂分离密蒙花黄色素,其产品质量得 到了很大的提高;马银海等用吸附树脂吸附分离甘蓝红色素也获得了良 好的效果。与精馏、结晶和有机溶剂萃取法及双水相分离技术相比,树 脂吸附方法具有下列优点:(1)吸附剂化学稳定性好,耐化学腐蚀,可重
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复使用;(2)选择性好,易于分离极性不同的物质;(3)无溶剂残留效应; (4)分离得到的产物具有良好的化学纯度;(5)吸附剂易于获取,价格低 廉;(6)操作条件温和,不破坏物质的性质,能耗低,操作简单方便,易 于工业化。由于具有上述优点,因此树脂吸附工艺在天然植物有效成分 提取中的应用越来越多(卢锦花,2001)。
凝胶层析是分子排阻过滤。凝胶层析所选用的支持物为凝胶颗粒, 在由单体聚合成凝胶时,形成大分子交联的分子网络,故有分子筛之 称。当含有不同分子大小的组分的样品进入凝胶层析柱后,各个组分就 向固定相的孔穴内扩散,组分的扩散程度取决于孔穴的大小和组分分子 大小。比孔穴孔径大的分子不能扩散到孔穴内部,完全被排阻在孔外, 只能在凝胶颗粒外的空间随流动相向下流动,它们经历的流程短,流动 速度快,所以首先流出;而较小的分子则可以完全渗透进入凝胶颗粒内 部,经历的流程长,流动速度慢,所以最后流出;而分子大小介于二者 之间的分子在流动中部分渗透,渗透的程度取决于它们分子的大小,所 以它们流出的时间介于二者之间,分子越大的组分越先流出,分子越小 的组分越后流出。这样样品经过凝胶层析后,各个组分便按分子从大到 小的顺序依次流出,从而达到了分离的目的。
凝胶层析是生物化学中一种常用的分离手段,它具有设备简单、操 作方便、样品回收率高、实验重复性好、特别是不改变样品生物学活性 等优点。中国农业大学赵晓丹,韩国 Enu-Jin Lee 都曾用 Sephadex-20 葡 聚糖凝胶分离纯化大蒜绿色素物质。Sephadex LH-20 是由葡聚糖 G-25 羟 丙基化加工而成,尤其适用于天然产物在有机溶剂中的纯化,同时适用 于分子类别非常相似的物质的分离和工业规模的制备,既可用于初步纯 化步骤,也可用于最终精制步骤。 1.4 天然有机化合物结构鉴定方法
30 年代发展的紫外(UV)光谱和 40 年代的红外(IR)光谱为化学 家提供了识别有机化合物生色基和官能团的有效方法。研究者可以采用 极少量的样品,非破坏性的实验得到有关结构的信息。
50 年代发展起来的质谱(MS)方法进一步带来革命性的影响,MS 实验可给出化合物的分子式,并且通过裂解方式提供分子的结构信息。
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质谱(MS)法是鉴定有机物结构的重要方法,其灵敏度非常高。MS 可 以测定分子量、分子式,EIMS 中的裂解碎片离子峰在不少情况下对推断 化合物的分子骨架很有用。有些类型的化合物可用 MS 确定分子结构片 段连接顺序。液相色谱-质谱联用(LC-MS)很适合极性分子的分离和结 构鉴定。它是分析分子量大、极性强的化合物不可缺少的分析仪器,已 在天然产物化学、植物药复方研究、生物化学、药代动力学、临床医 学、环保、化工领域得到广泛的应用。
对有机结构化学影响最大的谱学方法当推核磁共振(NMR)。目前 对核磁共振谱的研究主要集中在 1H 和 13C 两类原子核的图谱。氢的核磁 共振谱提供了三类极其有用的信息:化学位移、偶合常数、积分曲线。 应用这些信息,可以推测质子在碳胳上的位置。
在进行结构鉴定之前,尽可能多地获得与样品化学结构有关的各种 背景信息是非常必要的,信息量的多寡直接影响结构鉴定工作的速度。 在没有和或缺乏背景信息的情况下,可以直接通过多种波谱技术测定化 合物的结构(汪茂田,2004)。 1.5 大蒜产业的现状及前景
我国是大蒜的主产国之一,栽培面积大,年产量占世界总产量的 3/4,居世界首位,日本及东南亚市场 80%的大蒜是从我国进口。一直以 来我国多以鲜蒜销售为主,深加工产品少,经济效益相对较低。目前国 内大蒜加工产品主要有脱水制品,(包括脱水蒜片、蒜粉、蒜粒);保 鲜产品(包括保鲜大蒜、保鲜蒜米);速冻产品;腌渍产品(包括腌渍 蒜米、糖醋大蒜)等。在我国大蒜加工和贸易中腌渍产品占据了主要位 置;而在国外高品质、高价值的大蒜贸易品越来越受到食品工业的推崇 并且发展迅速。
国外,尤其美、英、日等发达国家非常重视大蒜的深加工,尤其现 代医学的发展,揭示了大蒜具有重要的药理活性以来,大蒜越来越受到 人们的重视,研制开发大蒜制品成为一种潮流,目前对大蒜的开发利 用,从针剂、片剂、粉剂到胶囊等用于临床已取得显著疗效。随着社会 发展、疾病更新、医疗发展,大蒜在人类的发展中体现了它的价值,从
11

出口大蒜头到加工成蒜片、蒜酱、蒜粉,又发展到提取大蒜精油、大蒜 素出口,大蒜深加工事业方兴未艾。
大蒜这一被世界许多国家视为珍品的物产,在我国一直未能被真正 开发出来,形成产业。在发达国家,大蒜素胶囊、胶丸、大蒜素复合饮 料,使用方便的大蒜调味等产品,成为家家必备的制品。作为中国,要 大力提高大蒜产业化水*,竭力提升大蒜产业层次,关键要开发高档无 公害及有机大蒜产品,亟需建立一批有机大蒜生产加工基地,利用科技 成果优势,提高大蒜产业整体效益;由于大蒜独特的药用和保健功能, 大蒜制品前景广阔,所以,要大力运用高科技提高大蒜产品品质和产 量,高新技术可促使传统产业朝低耗、高附加值方面发展。如生物技 术、现代食品加工的膜分离技术、大蒜良种化,以及优质高产栽培技术 等。同时,要尽快实现大蒜生产的标准化。只有通过建立大蒜生产、加 工、流通过程中的 HACCP、ISO9000 及 ISO1400 质量认证体系,取得大 蒜产品进入国际市场的通行证,以大蒜生产的标准化来确保我国特色农 产品大蒜的优良品质和良好信誉,拓展更大的国际市场空间。 1.6 研究的目的、内容及意义 1.6.1 研究目的
有关大蒜绿变的研究从上个世纪五六十年代就已经开始,绿变现象 是一个多步的复杂的过程,但是不能确切的阐述蒜绿变的机理及其反应 的详细过程,因此在生产中也不能准确的控制绿变现象,以达到生产要 求。而目前对大蒜绿变的研究,大都从反应物入手,通过化学方法探讨 其绿变机理,对绿变物质尚未明晰。本课题主要研究大蒜绿变现象的产 物是什么,通过对绿色素物质的分离纯化及其结构的研究,探讨大蒜绿 变的机理。 1.6.2 研究内容 1.6.2.1 首先建立高效液相色谱法分离检测大蒜绿色素的方法。以大蒜鳞 茎为原料,通过浸提法制备大蒜绿色素粗提液,采用固相萃取法,吸附 树脂法和凝胶层析法对大蒜绿色素进行分离纯化的研究。 1.6.2.2 利用液质联用技术测定大蒜绿色素的分子量,并通过核磁共振, 红外光谱技术对色素样品进行结构鉴定。
12

1.6.2.3 采用测定吸光值以及紫外-可见光谱扫描的方法,研究大蒜绿色 素的光稳定性,为大蒜绿变的机理研究提供了理论依据。

1.6.2.4 技术路线

大蒜原料



打破休眠



组织破碎机破碎



诱导变绿



绿色素粗提液



高效液相色谱分离测定 ← 分离纯化 → 柱层析法分离纯化





液质联用测定分子量 ← 液相色谱验证 ← 制备固体样品





确定绿色素物质的结构 ← 核磁共振、红外光谱分析结构

1.6.3 本研究的意义 大蒜含有丰富的蛋白质、脂肪、碳水化合物、维生素、胡萝卜素及
多种微量元素,含有人体中几乎所有的必需氨基酸,其中半胱氨酸、组 氨酸、赖氨酸的含量最高,并含有丰富的稀有元素锗、硒。大蒜有通五 脏、健脾胃、去湿寒、消肿痛、疗疮癣、治肾气、解瘟疫等功效。*代 医学研究发现,大蒜的主要活性物质是含硫化合物,试验和临床观察表 明,大蒜在抗菌、抗肿瘤、抗氧化、保护肝脏、防止动脉粥样硬化和血 小板凝集、防止血栓的形成、抗糖尿病以及增强机体免疫力等方面起着 十分重要的作用。
*些年,人们对大蒜众多的药理作用及功能的普遍认可,大蒜及其 系列产品的应用以及需求量也越来越大,然而国内大蒜产业现状不容乐

13

观,加快大蒜深加工技术的研究及产业化开发,保持我国大蒜产业在国 际市场上的领先地位,已成为大蒜产业当前迫切需要解决的问题。大蒜 加工过程中常常出现绿变现象,严重的影响了产品的外观质量,成为妨 碍大蒜进一步加工的主要问题。因此研究大蒜制品绿变的机理,对有效 控制绿变现象,达到规模化生产具有重要意义。
14

2 材料与方法

2.1 试验材料

大蒜(经冷库冷藏后已打破休眠),购于山东农业大学农贸市场

Supelco ENVI-18 小柱(3ML) ,Supelco ENVI-CARB 小 柱(6ML) ,

Waters OASIS HLB 小柱(6cc),Waters Sep-Pak Vac NH2 小柱(3cc)

AB-8 型大孔树脂,天津南开大学化工厂;Amberlite XAD-16 聚苯乙

烯型合成吸附树脂,美国罗门哈斯公司;葡聚糖凝胶树脂 Sephadex LH-

20,GE 公司

2.2 主要试剂

试剂名称

生产单位

纯级

甲醇

天津市永大化学试剂开发中心

分析纯

乙醇

天津市永大化学试剂开发中心

分析纯

盐酸

天津市永大化学试剂开发中心

分析纯

无水 Na2SO4 乙腈

天津市巴斯夫化工有限公司 天津市永大化学试剂开发中心

分析纯 分析纯

石油醚

天津市北方天医化学试剂厂

分析纯

甲酸

天津市巴斯夫化工有限公司

分析纯

醋酸

天津市凯通化学试剂有限公司

分析纯

甲醇

天津市永大化学试剂开发中心

色谱纯

乙腈

天津市永大化学试剂开发中心

色谱纯

2.3 主要仪器设备

名称型号

产地

高效液相色谱 LC-10Avp

日本岛津公司

Shim-pack vp-ODS(150mm×4.6mm) 日本岛津公司 色谱柱

Alltech Alltima C18(250mm×4.6mm) 美国奥泰公司 色谱柱

UV-2000 型分光光度计

尤尼柯上海仪器有限公司

UV-2102PC 扫描型紫外可见分光光度 尤尼柯上海仪器有限公司 计

15

TDL-4 低速台式大容量离心机 RE-52AA 旋转蒸发器 数显恒温水浴锅 组织破碎机 ZF7 三用紫外分析仪 西门子 KK24E00TI 冰箱 Z 型层析柱
Adventure 电子天*
Finnpipette 数字式移液器
818 型台面式 pH 测试仪
L1-COR 型光照度计 Agilent 1100 –ESI LC-MS 600MHz 核磁共振波谱仪 Nicolet380 型傅立叶变换红外光谱仪

上海安亭科学仪器厂 上海亚荣生化仪器厂 国华电器有限公司 上海海菱电器有限公司 上海康华生化仪器制造厂 西门子公司 上海华美实验仪器厂 奥豪斯国际贸易(上海)有 限公司 芬兰雷勃集团 尤尼柯(上海)仪器有限公 司 美国 FLUKE 公司 美国 Agilent 公司 美国 Varian 公司 美国热电集团

2.4 实验方法 2.4.1 大蒜绿色素粗提液制备的工艺流程
大蒜去皮,破碎→添加 2%柠檬酸→80℃水浴加热 30min→蒜泥变绿 →甲醇浸提→过滤(无水 Na2SO4 去水)→石油醚萃取除脂→35℃旋转蒸 发浓缩→添加 95%乙醇沉淀蛋白→离心→抽滤→旋转蒸发脱除部分溶剂 →粗提浓缩液备用(Enu-Jin Lee,2007;王岩,2006)。 操作要点: 2.4.1.1 溶剂浸提:甲醇(料液比为 1∶1)在 0~4℃环境下浸提蒜泥 24h。 2.4.1.2 石油醚萃取脱脂:加入与绿色素提取液相同体积的石油醚,萃取 除去其中的脂肪及醚溶性化合物。

16

2.4.1.3 添加 95%乙醇去除蛋白:按 1∶1 的比例向提取液中添加 95%乙 醇,溶液立刻出现白色混浊,4800r/min 离心 10min,取上清液抽滤并旋 转蒸发浓缩备用。 2.4.2 绿色素紫外-可见光谱扫描
采用扫描型紫外-可见分光光度计分别测量大蒜绿色素粗提液和对 照样品溶液的紫外—可见吸收光谱。 2.4.3 HPLC 法分离检测大蒜绿色素方法的建立
采用岛津 LC-10Avp 高效液相色谱仪对大蒜绿色素溶液进行分离检 测的研究。液相分离条件的选择主要包括柱型、流动相和检测波长等。 分别选用 Shim-pack vp-ODS(150mm×4.6mm)和 Alltech Alltima C18 (250mm×4.6mm)色谱柱对大蒜绿色素进行分析,筛选出较好的色谱 柱。在确定流动相的过程中,选择了不同浓度的甲醇-水体系(20%、 40% 、 60% 、 80% 甲 醇 ) 和 乙 睛 - 水 体 系 ( 10% 、 20% 、 30% 、 40% 、 50%、60%、70%、80%、90%乙睛),并加入 0.1%的甲酸。通过样品在 440nm 和 590nm 处分别检测的液相色谱图的对比分析,选出较好的检测 波长。样品进入液相色谱仪之前必须经过 0.2?m 微孔滤膜过滤。由此建 立的液相色谱方法和条件将应用到绿色素分离纯化和结构鉴定的研究 中。 2.4.4 固相萃取法分离纯化大蒜绿色素
分别选用 Supelco ENVI-18,ENVI-CARB;Waters OASIS HLB, Sep-Pak Vac NH2 四种固相萃取小柱对大蒜绿色素样品进行纯化。小柱分 别经过 5~10mL 甲醇活化,15~20mL 水洗预处理后,2mL 绿色素浓缩 液上样,20mL 水洗小柱,用乙醇/醋酸/水=40/5/55 的洗脱液淋洗小 柱,黄色素被洗脱下来,收集浓度较大的部分。再用 20mL 水冲洗小 柱,用不同浓度甲醇进行洗脱试验。收集绿色素溶液经过 0.2?m 微孔滤 膜后进行高效液相色谱分析,并与未经过柱层析纯化的样品进行对比。
绿色素分离纯化的研究是利用液相色谱图对比分析纯化前后样品中 杂质峰的减少情况,从而选择最佳的分离纯化方法。当我们利用二极管 阵列检测器分析绿色素粗提液样品时,发现其中杂质的吸收峰集中在 200~250nm,我们暂时选择 240nm 为杂质峰的检测波长。分离纯化实验
17

部分的液相条件为:Alltech Alltima C18(250mm×4.6mm,5um)色谱 柱 , 流 动 相 为 乙 腈 ∶ 水 =2 ∶ 8 ( 含 0.1% 甲 酸 ) , 柱 温 30 ℃ , 流 速 1.0mL/min,进样量 20?L。 2.4.5 吸附树脂法分离纯化大蒜绿色素
分别选用 AB-8 型和 XAD-16 型两种大孔树脂对大蒜绿色素样品进行 分离纯化。预处理将大孔树脂经过乙醇浸泡 2~4h 充分溶胀后,用 5BV (BV 为装柱的填料体积)的乙醇淋洗填料至流出液无异味且加水后不混 浊。然后水洗至无醇味,用 5%NaOH 浸泡 3h 水洗至中性。再用 2%HCl 浸泡 3h 并水洗至中性,备用。
将处理好的树脂湿法装柱 50mL,10mL 绿色素浓缩液上样,用 6BV 去离子水快速冲洗柱子(流速约 6BV/h),以甲醇洗脱色素,流速为 2BV/h。收集流出的绿色素溶液经过 0.2?m 的微孔滤膜,进行高效液相 色谱分析(液相色谱条件同 2.4.4),并与未经过柱层析纯化的样品进行 对比。 2.4.6 凝胶层析法分离纯化大蒜绿色素
选用葡聚糖凝胶树脂 Sephadex LH-20 对大蒜绿色素进行二次纯化。 室温下将 Sephadex LH-20 溶胀于层析液中 3h 以上,要避免过度搅拌, 尤其避免使用磁力搅拌器。将溶胀的凝胶湿法装柱 25mL,上样前,用甲 醇*衡层析柱 2 个柱体积,加入收集的经过 XAD-16 型大孔树脂纯化的 绿色素溶液 10mL,用 30mL 甲醇淋洗色素,流速在 1.2BV/h。收集流出 的绿色素溶液经过 0.2?m 的微孔滤膜,进行高效液相色谱分析(液相色 谱条件同 2.4.4),并与未经过柱层析纯化的样品进行对比。 2.4.7 XAD-16 大孔树脂分离纯化工艺的优化
本实验中无法确定绿色素样液的浓度,因此只能利用其在最大吸收 峰 590nm 处的吸光值研究各工艺参数,之后所提到的吸光值均在此检测 波长下测得。 2.4.7.1 不同上样液 pH 对 XAD-16 树脂吸附效果的影响
上柱液的 pH 值对树脂的吸附效果影响很重要。分别将 10ml 色素样 液(初始吸光值 0.245)与柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液按 1∶6 比例混合, 分别配成 pH 分别为 3,4,5,6 的溶液(色素在碱性条件下不稳定),此
18

时测定吸附前样品的吸光值 A0。分别将四个不同 pH 的样品加入 0.5g XAD-16 树脂于锥形瓶中,同步在振荡器上振荡 100min 后,测吸附后的 吸光值 A,并计算吸附率=(A0-A)/A0 2.4.7.2 洗脱剂及其浓度对 XAD-16 树脂洗脱的影响
称取 7 份每份为 1g 的 XAD-16 树脂于 7 个锥形瓶中,同时各加入 10ml 色素样液(初始吸光值 0.245),置于振荡器上振荡 60min,使树脂 吸附一定色素。取出树脂,分别加入 50%甲醇,70%甲醇,90%甲醇, 甲醇,乙醇,丙酮和正丁醇七种洗脱液各 50ml,振荡 30min,使色素从 树脂上解析,测解析液吸光值。解析液吸光值越高,说明该洗脱液对色 素的解析效果越好。 2.4.7.3 不同洗脱流速对 XAD-16 树脂洗脱的影响
将 XAD-16 树脂湿法装柱 15mL 进行动态解析实验。上样 15mL(初 始吸光值 0.245),吸附流速控制在 5BV/h,用 6BV 去离子水快速冲 洗,之后用 3BV 甲醇洗脱。洗脱流速分别为 1BV/h,2BV/h,3BV/h, 4BV/h。从加入甲醇的时刻起开始收集流出液,每 4mL 一个试管,直至 洗脱结束。分别测每个试管中绿色素溶液吸光值,制作洗脱曲线。 2.4.8 液质联用分析绿色素物质分子量
利用 Agilent 1100 LC-MS 液相色谱/质谱联用仪对纯化后的大蒜绿色 素溶液样品进行分析。液相色谱与质谱条件为:色谱柱为 Zobarx SB C18 (2.1×150mm) 色谱柱,流动相为乙腈∶水(0.1%TFA)=2∶8,进样体积 20?L,流速 0.5mL/min。电喷雾(ESl)离子源,正离子扫描,扫描范围: m/z=300~650,雾化气压力 45 psi。 2.4.9 核磁共振分析绿色素物质结构
由纯化后绿色素溶液的液相色谱图可以看出,大蒜绿色素两种组分 的保留时间十分接*,我们推测两种组分的结构极其相似,因此先将其 作为一种物质进行结构鉴定,推测绿色素物质的基本构架和基团。
将纯化后的大蒜绿色素溶液样品 35℃旋转蒸发脱除有机溶剂,再进 行冷冻干燥制成固体绿色素样品,进行核磁共振分析。 2.4.10 红外光谱分析绿色素物质结构
利用 Nicolet380 型傅立叶变换红外光谱仪对绿色素样品进行分析。
19

2.4.11 大蒜绿变色素光稳定性的研究 取大蒜绿色素粗提液样品,分别放置在室内自然光(1.203W/m2),
固定光源(5.874W/m2),室外自然光(80W/m2)和紫外线(功率 30W, 照射距离 18cm)光线下照射,每隔一定时间取样,于最大吸收波长处测 其吸光度,每个样品做三组*行,取最终的样品做光程扫描,与原始样 品对照。
20

3 结果与分析 3.1 大蒜绿色素紫外-可见吸收光谱图
大蒜绿色素粗提液及对照样品的紫外-可见吸收光谱图(如图 1 和 图 2)
图 1 大蒜绿色素溶液的吸收光谱图 Fig.1 Absorption spectrum of green pigment
图 2 对照样品的吸收光谱图 Fig.2 Absorption spectrum of CK
由图 1 与图 2 对比可知大蒜绿色素溶液的特征吸收在 440nm 和 590nm 处,与前人研究一致(Enu-Jin Lee,2007)。由图 1 可以看出,
21

选择 590nm 作为测定绿色素吸光度的检测波长,可以有效避免样品中杂 质的影响。同时,绿色素的提取溶剂为甲醇,而甲醇和水的截止波长分 别是 205nm 和 190nm(刘莉萍,1996),不影响液相色谱分析。因此可 初步选择 440nm 和 590nm 作为液相色谱的检测波长。 3.2 HPLC 法分离检测绿色素方法的建立 3.2.1 色谱柱的选择
分别研究了日本岛津的 Shim-pack vp-ODS(150mm×4.6mm)色谱 柱和美国奥泰的 Alltech Alltima C18(250mm×4.6mm)色谱柱对大蒜绿 色素粗提液的分离效果。其他液相色谱条件为:流动相为甲醇∶乙腈∶ 水=15∶15∶70,检测波长 440nm(由于扫描光谱图上看出 440nm 的吸 收峰强度明显高于 590nm,因此选择 440nm 作为检测波长),流速 0.6mL/min,柱温 30℃。

Volts Volts

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0.035

0.030

0.030

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0.025

0.020

0.020

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0.015

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0.005

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16

18

20

Minutes

图 3 岛津柱分离大蒜绿色素粗提液的色谱图

Fig.3 HPLC chromatogram of green pigment with Shimpack ODS column

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0.015

0.015

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0.010

Volts Volts

0.005

0.005

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0.000

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2

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6

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18

Minutes

图 4 奥泰柱分离大蒜绿色素粗提液的色谱图

-0.005 20

Fig.4 HPLC chromatogram of green pigment with Alltech Alltima C18 column

由于大蒜绿色素粗提液未经过柱层析纯化,必定存在杂质成分,因 此相同条件下出现的色谱峰越多说明该色谱柱对大蒜绿色素粗提液的分 离效果越好。由图 3,图 4 对比可知,岛津色谱柱对大蒜绿色素粗提液 中的组分吸附较强,洗脱困难,因此只出现两个色谱峰,且峰形较差。 而奥泰色谱柱分离大蒜绿色素粗提液时出现五个明显的色谱峰,说明对 其组分的分离效果较好,且峰形比较尖锐。同时也说明色谱柱越长,对 绿色素的分离效果越明显。因此选用 Alltech Alltima C18(250mm× 4.6mm)色谱柱进行以下的实验。
但由图 4 可以看出,色谱图出现肩峰,说明样品中组分较多,且色 谱条件还不能达到分离的目的。为保证流动相比例和检测波长等色谱条 件的确定,我们将绿色素粗提液经过 C18 固相萃取小柱初步纯化后再进 行以下实验,减少样品中杂质的影响,能更加有效的检测出绿色素物 质。 3.2.2 流动相的选择
根据大蒜绿色素物质属于中等偏上极性物质,且使用 C18 液相色谱 柱,通常选择不同浓度的甲醇-水体系或乙睛-水体系作为流动相。经 试验选择乙睛-水体系其峰形和分离效果优于甲醇-水体系,同时加入

23

适量的酸,可以进一步改善峰形和分离效果。其他液相条件为:检测波 长 440nm,流速 1.0mL/min,柱温 30℃。

0.04

0.04

0.03

0.03

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0.01

0.02 Volts
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Minutes

图 5 大蒜绿色素溶液的液相色谱图 Fig.5 HPLC chromatogram of green pigment

经过不同比例的乙睛-水体系的试验可知,流动相为乙腈∶水=2∶8 时,样品出现四个峰,除色谱峰个数较多之外,峰之间的保留时间差也 较大,向此流动相中加入 0.1%甲酸,使峰形更加尖锐对称,分离效果更 好(如图 5)。因此得出 HPLC 分离测定大蒜绿色素的流动相为乙腈∶ 水=2∶8(含 0.1%甲酸)。 3.2.3 检测波长的选择
由图 1 可知 440nm 和 590nm 都可以作为大蒜绿变色素的检测波长, 上图 5 是以 440nm 为检测波长的液相色谱图,再以 590nm 下液相色谱图 与之对比(如下图 6)。可以看出,选择 440nm 为检测波长,可以得到 分离较好且峰形尖锐的色谱图。其他液相条件为:流动相为乙腈∶水 =2∶8(含 0.1%甲酸),柱温 30℃,流速 1.0ml/min。

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0.008

0.008

0.006

0.006

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0.004

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2

3

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5

6

7

8

9

Minutes

图 6 590nm 下检测的大蒜绿色素液相色谱图

Fig.6 HPLC chromatogram of green pigment in 590nm
3.2.4 HPLC 法分离检测绿色素的最佳色谱条件及绿色素保留时间的初步

确定

试验建立了高效液相色谱法(HPLC)分离检测大蒜绿变色素的方法,

初步确定了检测大蒜绿变色素的最佳色谱条件如下:Alltech Alltima C18 ( 250mm×4.6mm)色谱柱,流动相为乙腈∶水 =2∶ 8 (含 0.1% 甲

酸),柱温 30℃,检测波长 440nm,流速 1.0mL/min。

至今未得到大蒜绿色素的标准品,但有研究表明大蒜绿色素物质由

蓝色素和黄色素两种成分组成。由图 5 分析得知,首先出现的 2.4min 的

峰为溶剂峰,由此可知,此液相条件下大蒜绿色素中两种物质的保留时

间分别为 2.89min 和 3.95min。

3.3 大蒜绿色素的分离纯化

3.3.1 固相萃取法分离纯化大蒜绿色素

我们分别将四种 SPE 小柱 ENVI-18、OASIS HLB、Sep-Pak NH2 和 ENVI-CARB 用于大蒜绿变色素的分离纯化实验中。四种商品化小柱填料

的极性不同,其中,ENVI-18 小柱和 OASIS HLB 属于 C18 填料反相柱, 比较适合绿色素物质的纯化,而 ENVI-CARB 活性炭填料小柱对色素吸

附严重,试验证明洗脱很困难,Sep-Pak Vac NH2 属于正相氨基柱,试验 证明洗脱也很困难。因此初步选定前两种小柱进行洗脱条件的研究以及

收集样品的高效液相色谱分析。

25

洗脱试验中小柱的活化、上样和洗脱均按照前文提到的方法,当色 素溶液完全被吸附后,柱体顶端绿色带集中且明显,下部分黄色带较 散。用不同浓度的甲醇进行洗脱试验,结果表明 80%~100%的甲醇洗脱 绿色素的效果最好。分别将收集的经过两种小柱纯化的绿色素溶液,过 0.2?m 滤膜过滤后进行高效液相色谱分析,与未经过小柱纯化的样品进 行对比。(如下图 7,8,9)。
图 7 未经过柱层析纯化的粗提绿色素溶液的 HPLC 谱图 Fig.7 HPLC chromatogram of green pigment without column chromatography
图 8 经过 Supelco ENVI-18 小柱纯化的绿色素溶液的 HPLC 谱图 Fig.8 HPLC chromatogram of green pigment through Supelco ENVI-18
26

图 9 经过 Waters OASIS HLB 小柱纯化的绿色素溶液的 HPLC 谱图 Fig.9 HPLC chromatogram of green pigment through Waters OASIS HLB
图 8,9 都可以看出保留时间在 2.89min 和 3.95min 的绿色素物质仍 然存在。由图 8 与图 7 对比可以看出,Supelco ENVI-18 小柱除去了保留 时间在 5~15min 内的大部分杂质,但是保留时间大约在 28.9min, 43.2min 和 45.5min 的杂质的浓度明显提高,成为了样品的主要成分,这 几种成分具体为何物质尚未明晰。由图 9 与图 7 对比可以看出,Waters OASIS HLB 小柱也除去了保留时间在 15min 之前的一部分杂质,但是效 果不如 Supelco ENVI-18 小柱明显,同时也有上述问题存在,保留时间为 28.9min 的杂质得到了富集。两种柱子对绿色素的纯化产生了一定的效 果,但是并不理想,由此可以看出单独使用固相萃取小柱并不能达到很 好的纯化效果。 3.3.2 吸附树脂法分离纯化大蒜绿色素
AB-8 型大孔树脂用于皂苷、黄酮、生物碱和色素的提取,复方中药 的有效成分浓缩和纯化,如:银杏黄酮、甜菊苷、栀子黄素、原花青素 等。Amberlite XAD-16 适合提取小分子的抗生素和植物有效成分,如黄 酮类,皂甙类物质。因此初步选用 AB-8 型和 XAD-16 型两种大孔树脂。
柱子的活化、上样和洗脱均按照前文提到的方法。上样后,AB-8 型 柱上的色素分布较散,色带呈浅黄绿色,而 XAD-16 型柱色带比较集 中,呈浅绿色。分别收集经过两种大孔树脂纯化的绿色素溶液样品,并
27

经过 0.2?m 滤膜过滤后进行高效液相色谱分析,与未经过柱层析纯化的 样品进行对比(如下图 10,11 与图 7 进行对比)。

图 10 经过 AB-8 型大孔树脂纯化的绿色素溶液的 HPLC 谱图 Fig.10 HPLC chromatogram of green pigment through AB-8 column chromatogram

0.15

0.10

0.05

0.15 0.10 0.05 0.00 -0.05 -0.10

Volts

Volts 0.00

-0.05

-0.10

0

10

20

30

40

50

60

Minutes

图 11 经过 XAD-16 型大孔树脂纯化的绿色素溶液的 HPLC 谱图

Fig.11 HPLC chromatogram of green pigment through XAD-16 column chromatography

28

图 10,11 都可以看出保留时间在 2.89min 和 3.95min 的绿色素物质 仍然存在。由图 10 与图 7 对比可以看出,AB-8 型大孔树脂去杂效果不 明显,且样品中杂质浓度有所增加,因此应放弃使用 AB-8 型大孔树脂 对绿色素溶液的分离纯化。而由图 11 与图 7 对比中明显看出,经过 XAD-16 型大孔树脂收集到绿色素溶液中,保留时间在 10min 之后的杂 质大部分被去除,说明这种柱材料对绿色素物质的分离纯化效果明显。 但从谱图上可以看出,经过大孔树脂处理后样品中仍有少量醇溶性杂 质,影响对绿色素物质结构的鉴定,因此需要进一步选择其他类型的柱 材料进行精制。 3.3.3 凝胶层析法分离纯化大蒜绿色素
Sephadex LH-20 是由葡聚糖 G-25 羟丙基化加工而成,属于分子筛凝 胶,尤其适用于天然产物在有机溶剂中的纯化,同时适用于分子类别非 常相似的物质的分离和工业规模的制备,既可用于初步纯化步骤,也可 用于最终精制步骤。因此本实验选用 Sephadex LH-20 作为样品二次纯化 的填料,经过双柱串联纯化后的大蒜绿色素的液相色谱图如下图 12。
图 12 经过 XAD-16 大孔树脂和 Sephadex LH-20 凝胶树脂纯化后的绿色素溶液的 HPLC 谱图
Fig.12 HPLC chromatogram of green pigment through XAD-16 and Sephadex LH-20 column chromatography
29

图 12 是经过双柱串联二次纯化后的大蒜绿色素溶液的液相色谱图, 从 图 中 可 以 看 出 保 留 时 间 在 10min 之 内 有 三 个 色 谱 峰 , 2.89min 和 3.95min 的色谱峰较明显,说明绿色素物质存在。由图可知保留时间在 10min 之后的杂质基本被除去,由此可以看出 Sephadex LH-20 凝胶树脂 对大蒜绿色素的纯化效果较好,能使样品达到较高纯度。 3.3.4 分离纯化工艺的优化 3.3.4.1 最佳上样液 pH 值的确定
通过静态吸附试验,可以得出 XAD-16 型大孔树脂对 pH 分别为 3、 4、5、6 的上样液的吸附效果(如下表 1)。

表 1 不同上样液 pH 对 XAD-16 树脂吸附效果的影响

Table 1. Effect of different pH on absorption performance of XAD-16

pH

3

4

5

6

吸附前 A0 吸附后 A

0.063 0.013

0.057 0.016

0.049 0.016

0.047 0. 013

吸附率(%)= A0-A/A0

79.4

71.9

67.3

72.3

对于 XAD-16 型大孔树脂来说,存在一个最适吸附 pH 值。由表 1 可 看出上样液 pH=3 时,树脂的吸附率最高,可能是由于吸附上去的吸附 质与吸附树脂的结合较牢固。当 pH>4 时,XAD-16 大孔树脂对大蒜绿 色素的吸附性减弱,可能是由于吸附树脂与吸附原液发生氢键吸附的能 力减弱。 3.3.4.2 解析剂的确定
通过静态解析试验,比较了不同解析剂对绿色素的解析效果。如下 图 13 所示,甲醇作为解析剂时,其解析液的吸光值高于其他有机溶剂, 且浓度越高解析效果越好,这与前人进行的提取试验结果一致。由于绿 色素在酸性环境下稳定,所以向甲醇中添加 0.2%的 HCl,以利于色素的 稳定和解析。因此我们选择含 0.2%HCl 的甲醇作为解析剂。

30

吸光值Absorbance

0.1 0.09 0.08 0.07 0.06 0.05 0.04 0.03 0.02 0.01
0 50%甲醇 70%甲醇 90%甲醇

甲醇

乙醇 正丁醇 丙酮

图 13 不同解析剂的洗脱效果 Fig13. Effect of different solvnt on desorption of garlic green pigment
3.3.4.3 洗脱流速的确定 洗脱流速一般都要求较慢,这是因为流速过快,洗脱性能差,洗脱

不完全,且耗费溶剂多;流速过慢,目标物质被洗脱出的时间相对较

长。本试验通过动态洗脱试验,比较了不同洗脱流速 1BV/h、2BV/h、 3BV/h、4BV/h 对洗脱效果的影响,结果见图 14。

吸光度 Absorbance

0.35 0.3
0.25 0.2
0.15 0.1
0.05 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

1BV/h 2BV/h 3BV/h 4BV/h

图 14 不同洗脱流速的解析效果 Fig14. Effect of different velocity on desorption of garlic green pigment

31

如图所示,洗脱流速为 1BV/h 时色素分布范围很集中,峰值最高, 且洗脱出的绿色素总量最多,但是绿色素被洗脱流出的时间明显晚于其 它流速;在 2BV/h 和 3BV/h 时,峰形宽,峰值低,且拖尾现象很严重; 在 4BV/h 时色素解析较快,色素峰相对集中,从峰值、出峰时间和峰形 等综合分析,我们选择 1BV/h 作为绿色素的最佳洗脱流速。 3.3.5 纯化后样品的吸收光谱图及液相色谱图
经过双柱串联纯化后的大蒜绿色素溶液样品进行紫外-可见吸收光谱 扫描,如图 15 所示,440nm 和 590nm 两个峰正是大蒜绿变色素的特征 吸收峰,说明此时样品中主要成分即为大蒜绿色素物质。
图 15 纯化后大蒜绿色素的吸收光谱图 Fig.15 Absorption spectrum of green pigment purifed of column chromatogram
32

图 16 纯化后大蒜绿色素的液相色谱图 Fig.16 HPLC chromatogram of green pigment purifed of column chromatogram
对纯化后的样品进行液相色谱分析(液相条件如 3.2.4 所述),由图 16 可以出大蒜绿色素两种组分的保留时间为 2.89min 和 3.95min。纯化后 样品中基本无其他杂质,经过以上双柱串联分离纯化后样品的纯度较 高,将其旋转蒸发并冷冻干燥后制成绿色素固体样品(如下图 17)。
图 17 绿色素固体样品 Fig.17 Solid sample of green pigment
33

大蒜绿色素两种组分的保留时间十分接*,我们推测两种组分的结 构极其相似,因此先将其作为一种物质进行结构鉴定,推测绿色素物质 的基本构架和基团。可以继续利用液质联用、核磁共振和红外光谱等技 术进行研究,解析物质结构。 3.4 液质联用分析绿色素物质分子量
对绿色素样品进行液质联用分析得到总离子流图如图 18,由各峰对 应的光谱图可以判断出保留时间在 1.77min 的峰为绿色素物质,其对应 光谱图如图 19,符合绿色素物质的特征吸收光谱。

图 18 绿色素样品的总离子流图 Fig.18 total ion chromatogram of green pigment

Chencong02 #110 RT: 1.82 AV: 1 SM: 15G NL: 7.40E5 microAU 246.0
100

80

Relative Absorbance

60

40

20
0 200

375.0 440.0

589.0

300

400

500

600

w avelength (nm)

744.0

700

800

图 19 绿色素物质对应的光谱图

Fig.19 Absorption spectrum of green pigment

34

WML0011 #98-108 RT: 1.86-2.00 AV: 4 NL: 9.62E6
F: + c ESI Full ms [ 300.00-650.00] 527.6
100

Relative Abundance

80 365.7
60

528.3

40
20
0 300

367.0 368.9 348.1 350 400

450.4 450

529.3
530.8 509.9 533.1 500 550

615.9 600 650

m/z

图 20 大蒜绿色素液相-电喷雾质谱联用谱图 Fig.20 Positive LC-ESI MS spectrum of green pigment

Chencong01_070406174551 #111 RT: 1.93 AV: 1 NL: 1.46E5 T: + c d Full ms2 365.84@35.00 [ 90.00-380.00]
203.0 100

80

Relative Abundance

60

185.1

243.7

40

20

203.7

244.3

0

100

150

200

250

300

350

m/z

图 21 大蒜绿色素 MS/MS 二级质谱图 Fig.21 Secondary mass spectrum of green pigment

由图 20 可以看出,绿色素物质的分子量为 527。图 21 为 m/z=365 的碎片的二级质谱图,由此得出,该碎片再经 ESI 轰击后裂解为 m/z 分别 是 185、203 和 243 的碎片离子。另一碎片离子 m/z=527-365=162。根据

反应过程中 PECSO(
35

)在蒜酶

作用下生成了硫代亚磺酸酯(R-S-S(O)-R′)色素中间体。推测绿色素

中可能含有 量恰好为 162。 3.5 核磁共振分析绿色素物质结构

的结构,其分子

图 22 大蒜绿色素 1H NMR 谱 Fig.22 1H NMR spectrum of green pigment

图 23 大蒜绿色素 13C NMR 谱 Fig.23 13C NMR spectrum of green pigment
36

核磁共振波谱还不能详细地解析绿色素物质的结构,只能由 1H 谱 (图 22)和 13C 谱(图 23)初步确定绿色素: ①有吡咯环,且上有含 H 的取代基 ②有不饱和键,C=C ③有甲基 3.6 红外光谱分析绿色素物质结构
65
60

55

50

45

%T 40

2930.73

35

30

1405.83

599.47

1637.10

1128.21

1030.66

25

3412.19

4000

3000

2000

1000

Wavenumbers (cm-1)

图 24 绿色素中蓝色素组分的红外光谱图

Fig.24 IR spectrum of blue component in green pigment

100

98

96

94

92

90

88

86

84

%T

82

80

78

76

74

72

70

68

66

4000

2929.95

935.02

1637.36

1403.69

1125.81

1034.60

582.49

3422.19

3000

2000

1000

Wavenumbers (cm-1)

图 25 绿色素中黄色素组分的红外光谱图

Fig.25 IR spectrum of yellow component in green pigment

37

将绿色素物质中分离得到的蓝色素和黄色素组分分别进行红外光谱 分析,如图 24,25。经两图对比可知,红外光谱极其相似,说明两种组 分的结构十分接*。我们可以由红外光谱初步确定绿色素:
①属于芳香族杂环化合物,推测是含 N 的吡咯衍生物。 由资料可知,芳香族在 1275~1025cm-1 有一到几个峰,由 C-C-C 变 形和 C-C-C 的 C-C 伸缩产生。含有 N-H 基团的芳香杂环化合物在 3500~3220cm-1 范围内有 N-H 振动伸缩吸收。在非极性溶剂的稀溶液 中,吡咯在 3495 cm-1 附*有窄的谱带,而在浓溶液中,于 3400 cm-1 附 *出现了一个变宽的谱带。 而由绿色素的红外谱图可知在 3412 cm-1 、1128 cm-1 和 1030 cm-1 有 强吸收,符合含有 N-H 基团的吡咯杂环化合物。吡咯环如下:
② 有-CH3、-OH 、C=C 和 C=S。 由 资 料 可 知 O-H 伸 缩 振 动 位 于 3650~3200cm-1 。 -CH3 波 数 在 2960~2870 cm-1。C=C 通常在 1680~1630cm-1 产生尖锐的谱带。C=S 伸 缩振动位于 1200~1050 cm-1。 而由绿色素的红外谱图可知在 3412 cm-1 、2930 cm-1 、1638cm-1 、 和 1030 cm-1 有强吸收,分别符合以上基团的振动吸收。
38

3.7 大蒜绿变色素光稳定性的研究

吸光度(A)

0.35 0.30 0.25 0.20 0.15 0.10 0.05 0.00
0

室内自然光 固定光源 室外自然光 紫外线

20

40

60

80

时间(h)

图 26 光照对色素稳定性的影响 Fig.26 The effect of lighting on stability of the pigment

由图 26 可见,色素对光的耐受性较差,室外自然光和紫外线对色素 影响明显。这两种处理后,绿色素均在 8h 之内迅速分解,溶液绿色褪 去,变为黄色,而紫外线对其影响最显著。

吸光值 Absorbance

0.6

原始样品

0.5

固定光源处理后样品

0.4

0.3

0.2

0.1

0

400

450

500

550

600

650

700

波 长 ( nm)

Wavelength(nm)

图 27 固定光源照射前后样品的吸收光谱对照 Fig.27 Comparison of absorption spectrum between the sample by

39

settled lighting and non-lighting
图 28 室外自然光照射前后样品的吸收光谱对照 Fig.28 Comparison of absorption spectrum between the sample
by extraventricular lighting and non-lighting
图 29 紫外线照射前后样品的吸收光谱对照 Fig.29 Comparison of absorption spectrum between the sample by
ultraviolet radiation and non-lighting
由图 28 和图 29 可以看出,室外自然光和紫外线照射后 590nm 处的 特征吸收峰消失,440nm 处的特征吸收峰峰值减小。室内自然光和固定 光源照射下的色素变化不明显,可能是由于光强度较弱,其能量未能破 坏色素结构。
40

4 讨论 4.1 大蒜绿变色素粗提液的制备
大蒜绿色素采用冷浸提法进行提取,王岩等经试验证明甲醇的提取 率比乙醇更高(王岩,2006),因此本实验采用甲醇做为提取溶剂。韩 国 Enu-Jin Lee 等将大蒜绿色素浸提液加入石油醚萃取除脂和其他醚溶性 杂质,并加乙醇去除胶体和蛋白类物质。本试验综合以上提取方法制备 大蒜绿色素粗提液。 4.2 大蒜绿色素的分离纯化
在大蒜绿色素的提取过程中发现,色素的极性属于中等偏上。赵晓 丹等对大蒜绿色素的分离纯化进行初步研究,通过对大孔树脂、聚丙烯 酰胺、弱阳离子交换树脂、硅胶、Sephadex LH-20 的研究,选出弱阳离 子交换树脂 CG-50、Sephadex LH-20 作为分离介质(赵晓丹,2004)。 本试验经过对固相萃取法,吸附树脂法和凝胶层析法分离纯化的研究比 较,确定了 XAD-16 型大孔树脂和 Sephadex LH-20 凝胶树脂串联纯化的 方法,并进一步优化了工艺参数。
大蒜绿色素的分离纯化对于其结构鉴定至关重要,因此若要彻底解 析该物质还需要通过对更多分离介质的系统研究,筛选出更好的分离纯 化方法,确保制备出绿色素纯品。 4.3 大蒜绿变色素的液相色谱分离
本实验建立了分离检测大蒜绿色素的液相色谱方法,并确定了绿色 素物质的保留时间,在国内属首创。既为液质联用分析物质分子量打下 基础,同时作为一种监测手段比较各种分离介质对绿色素纯化的效果。 试验采用反相色谱法,并选用分离有机物范围最宽、最有效 C18 色谱 柱。向流动相中加入少量强酸,可以使色谱峰的分离效果更好,更加尖 锐。
在有条件的情况下可进一步利用制备液相色谱收集目标峰的样品, 再进行结构研究,这样更能保证样品的单一组分,结构鉴定更加准确。
41

4.4 大蒜绿色素物质的结构解析 韩国 Enu-Jin Lee 等研究表明大蒜绿色素物质分子量约 412,并指出
该物质含一个 S 原子,奇数个 N 原子,25-30 个 C 原子,核磁共振证明 该物质含有 R-CH3,R-CH2-R,R-CH2-O,C=C,C=O 和苯环。可能的分 子式有以下几种:

C25H17N1O3S1 C25H33N3O1S1 C26H21N1O2S1 C27H25N1O1S1

C25H21N3O1S1 C25H49N1O1S1 C26H37N1O1S1 C28H13N1O1S1

本试验通过液质联用分析得出绿色素分子量为 527。核磁共振和红 外光谱表明绿色素物质:①有吡咯环,且上有含 H 的取代基 ②有不饱和 键,C=C ③有甲基。红外光谱初步确定绿色素:①属于芳香族杂环化合 物,推测是含 N 的吡咯衍生物 ②有-CH3、-OH、C=C 和 C=S。
国内外对于大蒜绿变色素这种未知物的结构研究较少,本研究与韩 国学者结果不同之处,主要是分子量的差异和是否含有苯环,对此需要 进一步验证。 4.5 大蒜绿色素稳定性的研究
试验过程中发现大蒜绿色素是一种稳定性较差的物质,光照对其影 响较大。因此通过不同光照条件下其变化情况可以看出,绿色素对光的 耐受性很差,特别是室外自然光和紫外线对其影响最明显。因此在试验 或者保存大蒜绿色素时应注意避光。 4.6 进一步研究方向 4.6.1 大蒜绿变色素的结构鉴定
虽然本试验对大蒜绿色素进行了初步的结构表征,但是结果并不精 确,需要继续利用各种有效方法进行研究,以彻底解析绿色素的结构。 在柱层析分离纯化之后可利用制备液相色谱收集目标峰的样品,再进行 结构研究,这样更能保证样品的单一组分,结构鉴定更加准确。
大蒜绿变是一个多步、复杂的反应过程,大蒜绿变物质结构的确定 对研究绿变的机理有着重要的意义。 4.6.2 大蒜绿变机理的研究

42

根据对大蒜色素中间体及色素结构研究的结果,采用合成的色素中 间体及γ–谷氨酰转肽酶、蒜氨酸酶作用产物,模拟大蒜绿变条件,设 计反应体系(色素中间体+绿变诱导因子),逐一验证绿变产生的过 程,进而推断、确定大蒜绿变的机理。
已进行的研究发现γ–谷氨酰转肽酶和蒜氨酸酶的活动与大蒜绿变 有较大的偶联关系,但只集中在酶活性研究,对其作用产物及其与大蒜 绿变的关系缺乏系统研究,进一步对γ–谷氨酰转肽酶和蒜氨酸酶的作 用产物及其与大蒜绿变的关系进行系统研究。
43

5 结论 5.1 大蒜绿变色素的分离纯化工艺的确定 5.1.1 高效液相色谱法分离检测大蒜绿变色素
试验建立了高效液相色谱法(HPLC)分离检测大蒜绿变色素的方法, 初步确定了检测大蒜绿变色素的最佳色谱条件如下:Alltech Alltima C18 ( 250mm × 4.6mm ) 色 谱 柱 , 流 动 相 为 乙 腈 ∶ 水 =2 ∶ 8 ( 含 0.1% 甲 酸),柱温 30℃,检测波长 440nm,流速 1.0mL/min。
在该液相色谱条件下,大蒜绿色素中两种物质的保留时间分别为 2.89min 和 3.95min。 5.1.2 大蒜绿变色素的分离纯化的方法
采用各种柱层析方法对大蒜绿变色素进行了分离纯化的研究,并利 用高效液相色谱对其效果进行检验。第一步纯化通过固相萃取法和吸附 树脂法进行比较,筛选出最佳柱材料为 XAD-16 型大孔吸附树脂。实验 表明,大蒜绿色素粗提液通过 XAD-16 型大孔树脂,用含 0.2%HCl 的甲 醇洗脱,洗脱流速在 1BV/h,收集到的绿色素流出液纯化效果较好。二 次纯化采用 Sephadex LH-20 凝胶层析法进行分离纯化,用纯甲醇作为洗 脱液,流速在 1.2BV/h,即可获得较高纯度的样品。
5.2 绿色素物质的分子量测定和结构鉴定 5.2.1 液质联用测定绿色素物质分子量
试验通过液质联用技术测定绿色素物质的分子量,结果显示绿色素 分子量为 527。 5 5.2 绿色素物质的结构鉴定
制备绿色素纯品,通过核磁共振,红外光谱技术对其进行结构鉴 定。结果表明,核磁共振初步确定绿色素:①有吡咯环,且上有含 H 的 取代基 ②有不饱和键,C=C ③有甲基。红外光谱初步确定绿色素:①属 于芳香族杂环化合物,推测是含 N 的吡咯衍生物 ②有-CH3、-OH、C=C 和 C=S。
5.3 大蒜绿变色素光稳定性的研究
44

采用测定吸光值以及紫外可见光扫描的方法,研究了各种不同性质 光线对色素稳定性的影响,试验结果表明,绿色素对光的耐受性较差, 室外自然光和紫外线对色素影响明显,其中紫外线对其影响最显著。光 照后绿色素中蓝色素组分完全消失,黄色素组分含量降低。
45

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52

致谢
本研究得到国家自然科学基金资助,项目编号:30571303 本研究是在导师乔旭光教授的精心指导下完成的。首先向给予我殷 切教诲的乔旭光教授表示我最真挚的感谢和最崇高的敬意。研究方向的 确定、研究内容实施、实验设计及论文的撰写都凝聚了导师大量的心血 和精力。导师渊博的知识、严谨的治学态度、敏锐开阔的思维方式、实 事求是的工作作风和孜孜不倦的敬业精神将使我终生受益。三年来恩师 在学术上的谆谆教诲和生活上无微不至的关怀和帮助,将令我终生难 忘。 感谢中科院过程工程研究所张贵峰老师、化学院尹洪宗教授、汪建 民教授,和山东省科学院分析检测中心的李福伟给于本试验的技术指导 和大力支持,感谢王明林教授、王晓教授、综合实验室马明老师和连玉 晶老师在本实验过程中的大力支持和无私帮助!感谢园产品加工实验室 全体同学的热心帮助和大力支持,在此向他们表示衷心的谢意! 感谢食品科学与工程学院的各位领导和老师在思想、工作和生活等 方面的关心和帮助! 最后,再次向所有给予我支持的老师、同学以及家人致以最诚挚的 谢意!
陈聪
2008.6
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攻读学位期间发表论文目录

论文题目

期刊名称

卷册号 页数 位次

大蒜绿变色素分离纯化的研 究
大蒜绿变色素分离纯化的研 究
Stability of the Green Pigment in Greening Garlic

中国食品科学技术学 会第五届年会暨第四 届东西方食品业高层 论坛论文集
《中国食物与营养》
14th World Congress of Food Science and Technology 会议论文 集

2007.11

300-301 1 已录用 1 收录

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